此画无可争议地成为世界美术宝库中最完美的典范杰作。这幅画，是他直接画在米兰一座修道院的餐厅墙上的。沿着餐桌坐着十二个门徒，形成四组，耶稣坐在餐桌的中央。他在一种悲伤的姿势中摊开了双手，示意门徒中有人要出卖他。该画421X903厘米，画面利用透视原理，使欣赏者感觉房间随画面作了自然延伸。为了构图使图做得比正常就餐的距离更近，并且分成四组，在耶稣周围形成波浪状的层次。越靠近耶稣的门徒越显得激动。耶稣坐在正中间，他摊开双手镇定自若，和周围紧张的门徒形成鲜明的对比。耶稣背后的门外是祥和的外景，明亮的天空在他头上仿佛一道光环。他的双眼注视画外，仿佛看穿了世间的一切炎凉
达·芬奇毕生创作中最负盛名之作。在众多同类题材的绘画作品里，此画被公认为空前之作，尤其以构思巧妙，布局卓越，细部写实和严格的体面关系而引人入胜。构图时，他将画面展现于饭厅一端的整块墙面，厅堂的透视构图与饭厅建筑结构相联结，使观者有身临其境之感。画面中的人物，其惊恐、愤怒、怀疑、剖白等神态，以及手势、眼神和行为，都刻画得精细入微、惟妙惟肖。这些典型性格的描绘与画题主旨密切配合，与构图的多样统一效果互为补充，使此画无可争议地成为世界美术宝库中最完美的作品。
要追溯“这幅永不安宁的杰作”（布克哈特语）的制作过程，我们首先要看一下温莎皇家图书馆收藏的一页笔记，笔记上有一幅早期用钢笔作的构图习作。这张习作仍然以传统的《最后的晚餐》的构图法为基础―――犹大没有与众人坐在一起，他坐在桌子的左侧，头扭向后面；而圣约翰则坐在耶稣旁边，已经睡着了，旨在表示在耶稣宣布他被出卖的消息的时候，他“斜靠在耶稣的怀里”。这两种形象在最后的版本里都被弃之不用。
这页纸上还有两幅相对独立的素描。左边那幅素描里出现了十个人物，也许这页纸已被人剪过，把三个人的形象剪掉了。这群人后面轻淡地画了些拱形结构，这是关于图画背景的最早想法，即“最后的晚餐”发生的“顶楼”。右边的素描中出现了四个人物，但画面重心主要放在耶稣和犹大这两个人物身上。列奥纳多在这里集中表现明确叛徒身份那戏剧性的一刻：“与我共用一个碟子的那个人将要背叛我。”画中的犹大从他的凳子上起身，正把手向那个碟子伸去。列奥纳多试着给耶稣的双手画出两种姿势――一种是手抬起来好像要伸向前方；另一种是手已经碰到了碟子，与叛徒的手发生短暂的接触。这幅小一些的素描突出了故事的焦点，找到了戏剧性的支点――两手相触的动人心魄那一刻。为了突出表现这一瞬间，列奥纳多把传统的“最后的晚餐”的故事追溯到《圣经》之前的一个场景，即圣餐仪式。
较小的那幅素描中还描绘了正在熟睡的圣约翰，耶稣的手臂放在他的背上，这里表现出耶稣的“仁爱”，正如《圣经》上所写，约翰是“耶稣所爱的”门徒。而在那些漠视宗教的怀疑论者们看来，约翰“斜靠在耶稣的怀里”是同性恋的表现。然而事实上，图中的约翰却是一名女性！一百年以后，在归结克里斯托夫.马洛的诸多亵渎行为中有一项便是：耶稣对约翰怀有“一种特别的爱”，并“把他当做所多玛的罪人利用”。
不久之后，列奥纳多又用红粉笔画了一幅草图，后来这幅红粉笔画又被其他人用墨水描了一遍，该图现存放在威尼斯学院美术馆。该草图显得比较粗糙，很大程度上应归咎于墨汁的影响，不过《最后的晚餐》均匀的布局在这幅草图上已初显端倪。众门徒被分成了几组，画面更注重人物的个性特征。为了明确人物身份，人物形象下面出现了匆忙写就的说明文字（其中菲利普被提到了两次）。但犹大仍然在桌子的靠近观者的一侧，约翰依然睡得很沉。
这些素描让我们看到了列奥纳多关于此画的早期想法。他迅速而聚精会神地做好微型蓝图，心中不停问自己――是这样画还是那样画？
但正如列奥纳多常会表现的那样，他的绘画基础非常扎实，尽管这些素描是第一批真正为圣玛利亚感恩教堂的《最后的晚餐》所作的习作，但我们在他的素描簿中找到了另一张年代更早的纸张，可以追溯到15世纪80年代，上面画着三幅互有关联的素描：一群人坐在桌子旁边，有一人单独坐在桌前，双手托着脑袋，还有一个人毫无疑问就是耶稣，他的手指指向那个命中注定的碟子。这三幅素描并不是为《最后的晚餐》所作的习作，因为画中只有五个人坐在桌旁愉快地聊天以打发时间，他们并不是耶稣的门徒。画中场景可能是发生在某次乡村的欢宴中，人们围坐在桌前。但不知是什么激发了列奥纳多的灵感，使他在同一页纸上迅速画下吃圣餐的基督这一令人心酸的场景，十五年之后这个想法终于开花结果。
《最后的晚餐》是白天。
